Пол главного героя выбирает сам игрок, как и в предыдущих частях серии. Так, пользователь может играть за Скотта и Сару Райдер. Приведённое ниже описание сюжета использует Райдера-мужчину.
В 2176 году предпринимательница Джиен Гарсон основала международный проект «Инициатива Андромеда», цель которого – колонизация скопления Элея в галактике Андромеды, где было обнаружено множество пригодных для жизни планет, и создание сообщения между Андромедой и Млечным Путём. Спустя 9 лет, в 2185 году (по времени это было сразу после событий Mass Effect 2), в сторону Андромеды был запущен ведущий командный центр «Нексус», укомплектованный представителями пяти рас (людьми, саларианцами, турианцами, азари и кроганами), с целью проложить путь запущенным через некоторое время четырём гигантским ковчегам с погруженными в анабиоз четырьмя расами (все упомянутые расы, кроме кроганов). На каждом из ковчегов находится командир – «Первопроходец», в задачу которого входит найти подходящую для своей расы планету. Спустя 634 года ковчеги прибывают в Андромеду.